Лекарственное средство для лечение вирусного гепатита С
продолжение Описание к изобретению патента
Пример 8. Синтез 6-АПА модифицированных пептидов.
Полученные на пептидном синтезаторе ABI 488А (Perkin Elmer, Norwalk, Conn.) методом F-moc (метод твердофазного синтеза пептидов с флуренилметоксикарбонил/трет-бутил производными аминокислот) пептиды, требовали стадии «снятия защиты» с 15 мМ трифлуороуксусной кислотой (TFA) и проводили выделение целевого продукта методом жидкостной хроматографией высокого давления (HPLC) согласно прилагаемым инструкциям.
Лиофильно высушенные 8-ми или 12-ти членные пептиды, со структурой указанной выше, использовали для создания конъюгатов с натриевой солью бромоацетилированной 6-АПА в 100 мМ бортном буфере (pH=8.3). Конъюгаты пептидов с 6-АПА вновь выделяли с помощью HPLC и лиофилизировали. Часть препарата комбинированного «гаптена» использовали для определения его способности ковалентно присоединяться к сывороточному альбумину человека (технология в общем виде описана в US Patent 4596768).
Пример 9. Химические модификации псевдовирионов.
Для определения и количественной оценки β-лактамазной активности псевдовирионов использовали методику, основанную на изменении окраски антибиотика нитроцефина при распаде его β-лактамной связи описанную ранее (И.В. Жильцов, И.С. Веремей, В.М. Семенов, И.И. Генералов, С.К. Егоров. Механизм гидролиза β-лактамной связи под воздействием альбумина // Иммунопатология, аллергология, инфектология 2011, №3: стр. 24-31). Для проведения экспериментов мы использовали химически чистый нитроцефин производства Calbiochem. При этом максимум поглощения продукта реакции меняется с 390 нм на 486 нм. Пептиды смешивали с псевдовирионами в «молярном» соотношении 10:1 в 10 мМ фосфатном буфере (pH=8,0). Реакцию проводили при комнатной температуре в течении 24 часов. Определение титра псевдовирионов до и после модификации, позволяет оценивать конечную концентрацию частиц в растворах (коэффициент 0,2).
Пример 10. Протокол введения псевдовирионов.
Препараты для введения проверяли на токсичность с помощью теста с Limulus амебным лизатом <0,1 ед/мкг. Введение проводили двух- или трехкратно с интервалом в две недели (титры псевдовирионов определенные с помощью чувствительного штамма HBCS140). При первичном введении титр псевдовирионов был ≤108. Методы введениявнутримышечный, пероральный или ректальный. Количество введений определяли по результатам оценки кожной пробы.
Пример 11. ИФА.
Уровень антител классов IgG и IgM определяли с помощью коммерческих наборов «РекомбиБест анти-ВГС» или, для определения ВГС-антигенов, с помощью "ВГС АГ/АТ-ИФА-БЕСТ" согласно прилагаемым инструкциям.
Пример 12. Определение CTL активности.
CTL (цитотоксический лимфоцит) активность определяли методом внутрикожной пробы с синтетическими коммерческими ВГС-специфическими антигенами фирмы «РекомбиБест» или НПО «Вектор».
Пример 13. Определение эффективности лечения псевдовирионами.
Техника подсчета: Набор для количественного RT-PCR (Becton Dickinson, USA), опрос по протоколу «QoL-36».
Предлагаемое лекарственное средство позволяет обеспечить эффективное лечение хронической ВГС-инфекции посредством полной стерилизации организма от клеток,зараженных РНК вирусом гепатита С, при минимизации нежелательных побочных воздействий, упростить процесс вакцинации и может быть реализовано в амбулаторных условиях на базе имеющегося оборудования.
Лекарственное средство для лечения вирусного гепатита С, отличающееся тем, что оно содержит модифицированные псевдовирионы фага MS2, оболочка которых создана белками «А» и «В» фага MS2, а часть геномной РНК, кодирующая «репликазу», заменена РНК, способной селективно уничтожать клетки, зараженные вирусом гепатита С или его РНК репликоном, при этом геном модифицированного псевдовириона фага MS2 характеризуется нуклеотидной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO 1.
Информация также предоставлена с содействия патентного сервиса