ДНК - вакцины против гепатита типа С

Проведено сравнение двух типов плазмид pHCV21 и pcDT, которые могут использоваться для ДНК-иммунизации. Первая из них содержит структурные гены белков E1 и E2 вириона HCV. Вторая - содержит антивирусную генетическую программу ( АГП ). ДНК плазмид, встроенных в геном клеток не токсична для них. Клетки с pHCV21 образуют белки вариона HCV, которые в качестве антигена для ИФА позволяют в 85% случаев подтвердить диагноз. Принцип конструрирования pcDT позволил получить клетки, флуорисценция которых увеличивается при их заражении РНК HCV ( HCV - сенсор ). Диагностическая ценность HCV- сенсора оказалась выше, так как флуорисценция развивалась не зависимо от генотипа инфекционной РНК HCV. Препараты ДНК - плазмид и ДНК - липосом не токсичны для крыс и мышей. При внутри брюшинном введении ДНК pHCV21 может, вероятно, интегрировать в геном клеток dustus thoracicus nodi lymphaticus у крысы. В заражённой РНК HCV  клетке, содержащей pcDT, последовательность АГП вступает в репликацию, зависимую от вирус - специфичной РНК - полимеразы, и превращается в и-РНК для А-субъединицы дифтерийного токсина. Убитые токсином клетки высвобождают суммарный HCV- антиген. В этом случае, гибель клеток, содержащих pcDT, наступала в присутствии не менее 1000 геном эквивалентов инфекционной РНК, но не зависимо от её генотипа. Полученный результат позволяет ожидать, что летальное действие АГП на заражённые клетки не будет зависtть от генотипа HCV и будет создавать иммунитет за счёт высвобождаемого суммарного HCV- антигена.


Принятые сокращения

АГП - антивирусная генетическая программа                                                HCV - вирус гепатита С

ДОТАП - 2,3 диомоилоксипропилметритиламмоний хлорид                     IgG - иммуноглобулин класса G

ФЭ - фосфаттидилэтаноламин                                                                             ptsl/ts19 - точковая мутация в гене ts19

( ДНК ) РНК - (дизокси ) рибонуклеиновая кислота                                        LD50 -даза летальная для 50%экспериментальных животных

(кДНК) РНК - комплиментарная ( ДНК ) РНК                                                     HepG2 :: pHCV21 - клеточная линия HepG2 c интегрированой в                                                                                                                                                геном плазмидой pHCV21 ( соответственно, pcDT и TGFT )

иРНК - информационная РНК 

ИФА - иммуноферментный анализ


Целью работы было сравнение двух плазмид , которыми можно иммунизировать против гепатита С. Таковыми были pHCV21 и pcDT. Действующим началом последней является АГП. Рост числа инфицированных HCV делает актуальным разработку эффективной вакцинации против этой инфекции. Наиболее перспективным  с этой точки зрения выглядит ДНК - вакцины.

          С учётом поставленной работы, её задачами были:

1 Разработка протокола получения штамов бактерий, в которых частота появления мутаций во фрагментах кДНК HCV предельно снижена

2 Оценка диагностической ценности и конструкции или принципа её создания

3 Оценка токсичности препаратов плазмил или содержащих плазмиды липосомных препаратов

4 Сравнительная оценка противовирусной активности 


                                материалы и методы

  Генно-инженерные методы описаны в руководстве [12]. Манипуляции с культурами и животными, трансфекцию Ca+2-фосфатным преципитатом ДНК, получение коньюгата пероксидазы с анти-HCV IgG и иммунодот проводили по [ 6 ]  Препараты содержащие до 1.5 гр. ДНК, получали по [12] и очищали от фрагментов хромосомной ДНК на колонках. Липосомные ( ДОТАП : ФЭ = 3 : 7; Весовое соотношение ДНК - липид = 1 : 40 ) готовили по методу [ 8 ]. РНК трансфекцию проводили по [ 11 ] с модификациями. Секвенирование проводили по [ 14 ]

                               результаты и обсуждения


Транскрипция клонированных фрагментов  кДНК HCV в E.coli приводит к искажениям в структуре транскрибируемой матрицы [ 1 ]. В процессе подбора реципиентов и плазмид - векторов со сниженной транскрипцией клонированных фрагментов установили, что сочетание дефекта в фосфоенол - пируват; углеводфосфотрансферазная система ( ptsI/ts19 ) и присутствие перемещающегося по генному элементу IS50 в генотипе штамма приводит к частоте точковых мутаций во вставках кДНК HCV менее 10/ -8 и полному отсутствию делеций [ 5 ]

Разработка протокола получения ДНК плазмид, содержащих не изменёные последовательности кДНК, позволила выделить варианты HepG2 : : pHCV21 и HepG2: :EGFP , образуещие либо структурные белки вириона, либо "зелёный белок" - EGFP [ 4, 15 ]. В первом случае были получены белки С, E1 и E2 HCV генотипа 1B, которые использовали в качестве антигенов для диагностики генотипа С методом твёрдовазного ИФА. Эффективность тест-системы со структурными белками HCV составила 85% от "идеала". Во втором случаеиспользовали HCV- сенсор- клетки, которые синтезировали и-РНК для EFGP и на её 3' и 5'- концах были последовательности геномной РНК HCV [ 13 ]. Заражение HCV- сенсора РНК HCV, даже не принадлежащие генотипу 1B [ 13 ] , приводит к увелечению интенсивности специфической флуоресценции. Чувствительность HCV-сенсора была ниже 1000 геном-эквивалентов РНК HCV [ 10 ]

                                                                                                                                                                                                                      Таблица 1


                                                     Сравнительная характеристика плазмид



Параметры сравненияpHCV21pcDT

Структура 

последовательности

Вектор- pSV3neo ( GenBank acc. №U02434

вставка ( от 5'- k 3' -) 2258 п.о. кДНК геномной 

РНК HCV ( 56 - 2313 п.о. из GenBank acc. №AF176573 )

Вектор - pSV3neo ( GenBank acc. №02434) 

вставка ( от 5' - k 3' - ) - 290 п.о. 5'- конца к ДНК геномной РНК HCV  генотипа

1B ( 53 - 342 п.о. из Gen-Bank acc. №AF176573),

576 п.о. из гена DT ( 240 - 809 п.о. из GenBank acc. №I06913 )

107 п.о. 3'- конца кДНК геномной РНК HCV

( 9526 - 9632 п.о. из GenBank acc. 

№AF176573 )

Продукт экспрессииструктурные белки варионакРНК для гена DT, фланкированного 5' - k 3' концевыми последовательностями геномной РНК HCV генотипа 1B

Диагностика

(эффективность и 

чувствительность)

Твёрдофазный ИФА ( 85%, сравним с другими системами )HCV - сенсор ( без "ошибок" на 28 образцах, > 1000 копий РНК
Токсичность препаратов ДНК и  ДНК - липосом

LD/50 >1,25 мг/г     и 

LD/50 > 0,25 мг/г

LD/50 >1,25 мг/г     и 

LD/50 > 0,25 мг/г

Морфологические изменения внутренних органовотсутствуют: ампликон при постановке ПЦР на тотальной ДНК из ductus thoracicus nodi lymphaticus с праймами F : 5'GGCGTTAGTATGAGTGTCGTGCAGC и R: 5'GATTCGTGCTCATGGTGCотсутствуют
Антивирусная активностьгипериммунизация ДНК- вакциной ( по материалам [ 7,16]Феномен DT-A [13] и HCV- зависимой цитотоксичности [2 ] с высвобождением суммарного HCV- антигена

Препараты ДНК плазмид не были токсичными для крыс и мышей при внутри брюшинном введении в дозе 1,25мг/гр массы. При морфологическом контроле внутренних органов показали,что печень, селезёнка и сердце не имели следов воспаления или других патологических  процессов. Препараты ДНК липосом  в максимальной концентрации 0,25мл/гр массы также при внутри брюшинном введении не вызывали гибели животных ( крыс ). При морфологическом исследовании внутренних органов также не обнаружили отклонений от контроля ( животным вводили с 0,15М NaCL ). У одного самца крысы в тотальной ДНК, выделенной из материала ductus thoracicus nodi lymphaticus ( поддифрагмальных лимфотических узлов ), методом ПЦР обнаружили последовательности кДНК HCV, характерные для pHCV21. Вероятно,  обнаружили случай интеграции pHCV21 в геном клеток.

При отсутствии в нашем распоряжении разработанной модели заражения HCV на шимпанзе, антивирусную активность проверяли на клетках HepG2 : : pcDT. Эти клетки образуют РНК АГП ( более 10 копий на клетку ) в течении 2 лет без видимого токсического влияния. Когда же в 10/6 клеток носителей АГП вводили РНК HCV ( выделена из крови больного гепатитом С с выраженной вирусемией ( 10/8 геном-эквивалентов/мл ) , то через 10-15 часов после трансфекции, в тотальном препарате клеточной РНК методом ОТ-ПЦР регистрировали последовательности и-РНК ( более одной копий на клетку ), программирующие в трансляции А-субъединицу дефтирийного токсина ( DT-A ). Трансфекция в присутствии 10мкМ дирибонуклеотида ApU ( IA/50= 0,3 нМ [ 2] ) - конкурентного ингибитора DT-A  - приводило к задержке появления и-РНК для DT-A, в среднем, на 15-20 часов. В концентрации 20 ед/мл интерферон а также задерживал появление и-РНК для DT-A ( на 25-40 часов ). Во всех экспериментах по трансфекции РНК HCV клеток HepG2 : : pcDT показали накопление суммарных HCV-антигенов в процессе инфекции. Так как на клетках HepG2 формирования зрелых варионов HCV не описано, оценка эффективности применения АГП в качестве противовирусного препарата ещё впереди.

           В литературе, посвящённой ДНК-иммунизации, заражённых HCV шимпанзе, с помощью плазмид, кодирующих белки Е1 и Е2 , утверждается необходимость получения гипериммунизации [7]. Эффект может быть усилен при использовании вторичной иммунизации с помощью иммуногенного пептида [ 16]. Тем не менее, нет никаких доказательств защиты от различных генотипов HCV.


                                                         выводы

Сравнение ДНК- вакцин, приготовленных на основе плазмид pHCV21 или pcDT, которые могут сделать авторы на основе собственных и литературных данных, указывает на способность pcDT, реагировать на геномную РНК HCV различных генотипов. Возможно, при этом будет происходить  иммунизация против циркулирующих в организме линий возбудителя.    https://immunoup.com/about_us


                                                      список литературы


 1   Гершанович В.Н. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.  - 1998. - Т. З,  - С. 8-15

 2   Патент РФ № 2158139 " Способ селективного уничтожения клеток ( варианты )"

 3   Патент РФ № 2159285 " Плазмида pcDT, способ её применения и получения"

 4   Сергиенко В.И., Мартынов А.К., Сивов И.Г., // Иммунология. - 1999. - № 9. -С. 54-57

 5   Сивов И.Г., Большакова Е.Н.,Романовская Г.Б., // V Международный конгресс по иммунореабилитации ( Тезисы докладов ). Пальма-де-Мальорка, Испания 1999

 6   Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E., et al // Current protocols in molecular biology.  John Wiley&Sons, Ney-York, Chichester, Toronto, Singapore. 1996

 7   Bassett S.E. Tomas D.L., Brasky K.M., Lanford R.E., // J. Virol. - 1999. V. 73, №2. - Р . 1118-1126.

 8   Сhesnoy S., Huang L., // Annu. Rev. Biophys/ Biomol. Struct,- 2000. V. 29. - P. 27-47

 9   Gurunathan S., Kliman D.M., Seder R.A., // Annu. Rev. Immunoul. - 2000  V. 18. - P. 927-974.

10  Kaneko S.,Murakami S., Unoura M., Kobayashi K., // J.Med. Virol. - 1992.- V. 37. - P. 278-282.

11  Kleinschmidt A. M., Pederson T., // Proc. Nath. Acad. Sci. USA. - 1990. - V. 87. - №3 - P. 1283-1287.

12  Sambrook k., Fritsch E. F., Maniatis T., // Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY. - 1989.

13  Sergienko V.I., Martynov A. K., Sivov I.G., // International Jurnal of Immunoreha-bilitation. - 2000. - V. 2. - №3. - P. 24-28.

14  Smith L.M., sanders J.Z.,  Kaiser r.J., Hughes P., Dodd C., Connel C.R., Heiner C., Kent S.B.H. //Nature. -1992.- V.- 321 ( 12 june ). - P. 674-679.

15  Tsien R.Y., //Annu. Rev. Biochem. - 1998. - V.67. P. 509-544.

16  Zucchelli S., Capone S., Fattori E.,  et al  // J. Virol. - 2000.- V. 74, - №24. - P. 11598-11607 



* Работа выполнена по теме программы " ДНК - вакцины против гепатита типа С " 

Сивов И.Г., Мартынов А.К, Сергиенко В.И.

НИИ физико-химической медицины Минздрава России, Москва


P.S.   Материалы предоставлены с согласия авторов работы
















Написать отзыв

Внимание: HTML не поддерживается! Используйте обычный текст.
    Плохо           Хорошо

Популярные Статьи

Как приготовление пищи на газовой плите влияет на развитие онкологии?

Как приготовление пищи на газовой плите влияет на развитие онкологии?

Большинство людей, живущих в цивилизованных странах мира готовят пищу с помощью газовой плиты. Все мы привыкли считать такой вид приготовления самым удобным и разнообразным. Однако не так давно и..

Онкология лечится СТОпроцентно - Принцип работы препарата

Онкология лечится СТОпроцентно - Принцип работы препарата

В этой статье мы опишем в общих чертах механизм, которым происходит лечение этим препаратом. В любом организме млекопитающих существует группа клеток которая отвечает за защиту организма от инфекции.Э..

Повороты судьбы

Повороты судьбы

Онкологические заболевания в мире на сегодняшний день занимают вторую строчку по смертности, после сосудисто — сердечных. Интересный факт, что ни сосудисто — сердечные, ни онкологические болезни не пе..

Закрытие национальной онкологической программы

Закрытие национальной онкологической программы

Тревожные новости прошли несколько недель назад в ведущих СМИ. Правозащитники, пациенты и врачи настоятельно требуют провести тщательную ревизию онкологической службы: составить подробную опись ..